Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний
Новые возможности

Практическое руководство по интерпретации полученных результатов

М.В. Маркина, В. В. Романов

Общая часть
Диагностика антител класса IgM/IgG к ВПГ-1 и ВПГ-2 методом иммуноблоттинга
Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга с рекомбинантными антигенами с возможностью определения стадии инфекции
Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга
Диагностика антител класса IgG к вирусу краснухи методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции
Диагностика антител класса IgМ к инфекциям TORCH-комплекса методом иммуноблоттинга
Диагностика антител класса IgМ/IgG к вирусу Эпштейна-Барра методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции
Диагностика антител класса IgG к вирусу гепатита С методом иммуноблоттинга
Правила забора биоматериала для исследования на иммуноблоте

1. Общая часть

Иммуноблоттинг (иммуноблот) - высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РПГА или ИФА.

Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов - появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.

Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

ООО "Лабораторная диагностика" использует иммуноблоттинговые наборы для выявления антител к возбудителям различных заболеваний фирмы "EUROIMMUN" (Германия), "MIKROGEN" (Германия):

ВПГ 1 и ВПГ 2 IgM/IgG (герпесвирусная инфекция)
ЦМВ IgM/IgG (цитомегаловирусная инфекция)
Краснуха IgG
TORCH-профиль IgM (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)
ВЭБ IgM/IgG (вирусная инфекция Эпштейна-Барра)
ВГС IgG (вирусный гепатит С)

Используют наборы двух типов - вестерн-блот и лайн-блот.

Вестерн-блот: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются в порядке молекулярной массы (рис. 1). На мембраны могут быть также нанесены 1-2 дополнительные линии с клинически значимыми антигенами (вестерн-лайн блот). Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.

Рис. 1. Вестерн-блот для диагностики ВЭБ-инфекции.

Лайн-блот: В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены только клинически значимые антигены (нативные, синтетические или рекомбинантные) в определенном порядке. Такой подход используется при дифференциальной диагностике нескольких инфекций на одном стрипе (рис.2.).

Рис. 2. Лайн-блот для диагностики TORCH-инфекций.

Возможность обнаружить антитела к конкретным антигенам возбудителя позволяет оценить значимость этих антител (специфичность для данного этиологического агента), исключить реакцию на перекрестные антигены. Это и отличает иммуноблоттинг от ИФА, где в качестве антигена могут быть использованы различные комбинации антигенных детерминант - как специфичные, так и нет, дающих перекрестные реакции с другими возбудителями. В другом случае, при получении положительного результата в ИФА можно только предполагать, что он является следствием перекрестного реагирования, а в случае иммуноблоттинга это доказательно.

2. Диагностика антител класса IgM/IgG к ВПГ-1 и ВПГ-2 методом иммуноблоттинга

Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgМ-антитела к вирусу простого герпеса 1 и вирусу простого герпеса 2 и/или IgG-антитела к вирусу простого герпеса 1 и вирусу простого герпеса 2.

Антигены: Источником антигенов для тестов Anti-HSV-1 / HSV-2 EUROLINE-WB (EUROIMMUN, Германия) является полный комплекс антигенов ВПГ-1 и гликопротеин G-2 ВПГ-2, очищенный аффинной хроматографией. Культивируемые вирусы простого герпеса 1 типа разделяются на отдельные вирусные белки с различным молекулярным весом методом прерывистого электрофореза в полиакриламидном геле и эти белки (вирусные антигены) переносятся на нитроцеллюлозную мембрану стрипов. Затем стрипы дополнительно покрываются мембранным чипом, содержащим тонкую линию очищенного гликопротеина G-2 ВПГ-2.

Специфичность антигенов, нанесенных на стрипы:

Полоса	Молекулярный вес	Антиген	Специфичность
gC-1	130 кДа	Гликопротеин C-1 (gC-1) ВПГ-1	Высокоспецифичен для вируса простого герпеса типа 1
gB-2	120 кДа	Гликопротеин B-1 (gB-1) ВПГ-1	Специфичен для вирусов простого герпеса
gD-1	60 кДа	Гликопротеин D-1 (gD-1) ВПГ-1	Специфичен для вирусов простого герпеса
gG-2		Гликопротеин G-2 (gG-2) ВПГ-2	Высокоспецифичен для вируса простого герпеса типа 2

Интерпретация результатов по IgG-антителам:

Результаты постановки позволяют обнаружить ВПГ-инфекцию 1 и/или 2 типа.

Реактивная полоса антигена	Результат
Полос нет совсем или видны полосы неопределенной принадлежности	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и ВПГ-2
Проявляется полоса антигена gC-1 и, по крайней мере одна из полос других антигенов ВПГ-1; нет полосы gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и Отрицательный по антителам к ВПГ-2
Проявляется только полоса антигена gG-2 ВПГ-2	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и Положительный по антителам к ВПГ-2
Проявляется полоса антигена gC-1 и, по крайней мере одна из полос других антигенов ВПГ-1; есть полоса gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и Положительный по антителам к ВПГ-2

Интерпретация результатов по IgМ-антителам:

Для обнаружения IgM-антител постановка теста такая же, как и для IgG, за исключением использования другого ферментного конъюгата (антител к IgM человека, конъюгированных с щелочной фосфатазой).

Реактивная полоса антигена	Результат
Полос нет совсем или видны полосы неопределенной принадлежности	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и ВПГ-2
Проявляется полоса антигена gC-1 и нет полосы gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и Отрицательный по антителам к ВПГ-2
Нет полосы антигена gC-1 и проявляется полоса антигена gG-2 ВПГ-2	Отрицательный по антителам к ВПГ-1 и Положительный по антителам к ВПГ-2
Проявляется полосы антигенов gC-1 и антигена gG-2 ВПГ-2.	Положительный по антителам к ВПГ-1 и Положительный по антителам к ВПГ-2

3. Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга с рекомбинантными антигенами с возможностью определения стадии инфекции

Иммуноблот для качественного определения IgG и/или IgM антител против цитомегаловируса в сыворотке или плазме крови человека. Используется для подтверждения положительных результатов скрининговых тестов.

Антигены: Специфические цитомегаловирусные антигены для RecomBlot ЦМВ (MIKROGEN, Германия) производятся с помощью рекомбинантных клеток E.coli. Полученные очищенные рекомбинантные антигены разделяются согласно своему молекулярному весу в полиакриламидном геле с помощью электрофореза, а затем переносятся на нитроцеллюлозную мембрану.

Используемые рекомбинантные антигены:

Рекомби-нантный антиген	Открытая для чтения часть/протеин	Молекулярный вес рекомбинант-ного антигена	Классификация протеина
IE1	UL123/IE1/1	53	Неструктурный протеин, «немедленный ранний» протеин
p150	UL32/pp150	50	Протеин оболочки
CM2	UL44,UL57/p52 (DBP)	45	Неструктурный протеин
p65	UL83/pp65	31	Протеин оболочки
gB1	UL55/gB	25	Мембранный гликопротеин gB
gB2	UL55/gB	18	Мембранный гликопротеин gB

Вследствие того, что используются рекомбинантные антигены, чувствительность и специфичность этого теста выше, чем иммуноблоттинга, где использовались живые культуры вируса (см. следующую главу), поэтому этот иммуноблот применяют для подтверждения положительных результатов скрининговых тестов. Однако иммуноблот с электрофоретически разделенными антигенами культивируемых вирусов целесообразно использовать при дифференциальной диагностике на ранних стадиях инфекции (когда строгоспецифичные антитела еще не наработались в достаточном количестве, но по совокупности антител к неспецифичным антигенам можно судить о начинающейся инфекции).

Оценка интенсивности линий

Интенсивность линий на стрипах пациентов сравнивается с контрольным стрипом.

Линии	Интенсивность
Отрицательная	-
Очень слабая интенсивность (интенсивность слабее, чем у линии р150 контроля)	+/-
Слабая интенсивность (та же самая интенсивность, что у линии р150 контроля)	+
Хорошо видимая интенсивность (более сильная интенсивность, чем у линии р150 контроля)	2+
Очень сильная интенсивность	3+

Интерпретация результатов IgG-антител:

· Нет ЦМВ-специфических линий

· Линии с очень слабой интенсивностью (соответствующие +/-)

· Изолированная линия р65 слабой интенсивности (соответствующая +) даже вместе с другими линиями очень слабой интенсивности (соответствующие +/-)

IgG - отрицательный

· Антитела против р150, по крайней мере, слабой интенсивности (соответствующие +), (обычно также имеются антитела против большего числа антигенов)

· р150 отрицательная, СМ2 – хорошо видимой интенсивности (соответствующая 2+) и, по крайней мере, одна другая линия слабой интенсивности (соответствующая +)

IgG - положительный

· Все другие варианты

IgG - пограничный

Интерпретация результатов IgМ-антител:

· Нет ЦМВ-специфических линий

· Линии с очень слабой интенсивностью (соответствующие +/-)

· Изолированная линия (за исключением р150) слабой интенсивности (соответствующая +), в случае линии р65 даже вместе с другими линиями очень слабой интенсивности (соответствующая +/-)

IgМ - отрицательный

· Антитела против р150, по крайней мере, слабой интенсивности (соответствующие +), и по крайней мере, одна другая линия слабой интенсивности (соответствующая +)

· Изолированная р150 линия с хорошо видимой интенсивностью (соответствующая 2+)

IgМ - положительный

· Все другие варианты

IgМ - пограничный

Серологический иммунный ответ у человека к ЦМВ-инфекции высоко вариабелен. IgM-антитела могут персистировать несколько лет после инфекции, а при первичной ифекции могут быть очень низкие или даже неопределяемые уровни IgM-антител. Для оценки иммунного статуса при ЦМВ-инфекции IgG и IgM-антитела должны всегда рассматриваться вместе.

Сочетание антител:

Иммуноблот ЦМВ-IgG положительный, реактивность к gB2 отрицательная (возможна реактивность к gB1)

Иммуноблот ЦМВ-IgM положительный или отрицательный

Подозревается первичная инфекция
Или
Подозревается ЦМВ-инфекция, по крайней мере спустя 6-8 недель (без gB2-ответа)
Для верификации двух вариантов должно быть выполнено определение авидности.

Иммуноблот ЦМВ-IgG положительный, реактивность к р150 и gB2 отрицательная

Иммуноблот ЦМВ-IgM положительный

Подозревается первичная инфекция в пределах 6-8 недель после инфицирования

Иммуноблот ЦМВ-IgG положительный, реактивность к gB2, по крайней мере, слабая интенсивность линии (реактивность к gB1 положительная или отрицательная)

Иммуноблот ЦМВ-IgM положительный (оставшиеся IgM-антитела) или уже отрицательный

Подозревается ЦМВ-инфекция, по крайней мере 6-8 недель спустя

Иммуноблот ЦМВ-IgG положительный с выявленной реактивностью к р150 (с реактивностью к gB1 и/или gB2)

Иммуноблот ЦМВ-IgM главным образом отрицательный (положительный в случае персистенции IgM-антител против р150)

Подозревается прошедшая ЦМВ-инфекция (обычно по крайней мере спустя 6 месяцев после инфицирования)

Примечания по интерпретации теста:

Антитела к р150 обычно вырабатываются при каждой ЦМВ-инфекции. Может случаться, что IgG-антитела к р150 не обнаруживаются сразу после первичной инфекции.
При первичной инфекции обнаруживаются IgG-антитела к р150, а также к IE1, CM2 и р65. Нет антител к гликопротеинам (gB1, gB2). Обычно IgM-антитела положительные (IgM-антитела снижаются после 6-12 недель).
Для давно прошедшей инфекции (обычно 6 месяцев спустя) является типичным IgG-реактивность против р150 и против гликопротеинов (gB1 и/или gB2) с дальнейшей IgG-реактивностью и отрицательным IgM-результатом.
Антитела против gB1 могут появиться рано, спустя неделю после сероконверсии. Тогда как антитела к gB2 обнаруживаются самое раннее через 6-8 недель. Таким образом, присутствие анти-gB2 наиболее вероятно исключает первичную ЦМВ-инфекцию в пределах первых 6-8 недель. Необходимо дифференцировать, если обнаруживаются только антитела к gB1: это может быть первичная инфекция с очень ранним формированием анти-gB1 или прошедшая инфекция без gB2-ответа.
Случаи прошедшей инфекции без gB2- и/или gB1-ответа составляют около 20%. Разграничение между первичной инфекцией (когда еще нет антител к gB1 и/или gB2) и прошедшей инфекцией без gB2- и/или gB1-ответа является возможным с помощью определения авидности IgG-антител.
На реактивацию может указывать длительная персистенция и высокий титр IgG-антител к р150, к мембранным гликопротеинам (gB1, gB2), к IE1, CM2 и р65 в комбинации с положительными IgM-антителами.
Учитывая вариабельность иммунного ответа, серологические результаты должны всегда рассматриваться вместе с клинической картиной.

4. Диагностика антител класса IgM/IgG к цитомегаловирусу методом иммуноблоттинга

Иммуноблот для качественного определения IgG и/или IgM антител против цитомегаловируса в сыворотке или плазме человека.

Антигены: Источник антигенов для набора Anti-CMV-WESTERNBLOT (EUROIMMUN, Германия) получают из детально подобранных штаммов ЦМВ. Искусственно выращенный ЦМВ солюбилизировали с помощью додецилсульфата натрия и затем разделили солюбилизированные белки методом электрофореза в полиакриламидном геле в соответствии с их молекулярными массами и переносли разделенные белки на нитроцеллюлозу.

Специфичность антигенов на стрипе:

Полоса	Антиген	Описание	Категория
130 кДа	pp130	Фосфопротеиновый антиген: UL57	3
65 кДа	pp65	Тегументный фосфопротеиновый антиген: UL83	1
55 кДа	p55	Гликопротеин В антиген gB: UL55	2
52 кДа	pp52	Фосфопротеиновый антиген:UL44	2
38 кДа	p38		2
28 кДа	pp28	Капсидный протеиновый антиген: UL99	3

Для оценки сигнала принимают во внимание положение и интенсивность окрашивания, так как отрицательные сыворотки дают слабое окрашивание индивидуальных полос. Антигены ЦМВ можно в основном разделить на три категории:

Разделение на категории:

Категория	Антигены
1	Перекрестно-реагирующий антиген с молекулярной массой 65 кДа и неопределенные антигены.
2	Низко специфичный антиген с молекулярными массами: 55 кДа, 52 кДа и 38 кДа
3	Высоко специфичные антигены с молекулярными массами: 130 кДа и 28 кДа.

Интерпретация результатов:

Все результаты Anti-CMV-WESTERNBLOT можно разделить на отрицательные, промежуточные (пограничные) и положительные.

Результат	Характеристики
Отрицательный	Нет полос, или полоса категории 1, или одна слабая полоса категории 2.
Промежуточный	Слабая полоса категории 3 или более чем одна полоса категории 2. Рекомендуется через несколько недель взять новый образец и протестировать его снова.
Положительный	Одна полоса категории 3. В дополнение можно видеть много полос категории 1 и 2.

5. Диагностика антител класса IgG к вирусу краснухи методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции

Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgG-антитела к антигенам вируса краснухи с восможностью определения стадии инфекции. Рекомендован для прояснения сомнительных IgM-результатов, для дифференцировки первичной инфекции и реинфекции.

Антигены: Рекомбинантные антигены (Е2, Е1, С, Е1-Е2-димер) для набора RecomBlot Rubella IgG (MIKROGEN, Германия) получают с помощью овариальных клеток хомяков. Приготовленные очищенные антигены не содержат интерферирующих или перекрестно реагирующих компонентов.

Кинетинка IgG-антительного ответа к 3-м структурным антигенам краснухи Е1, Е2 и С различается. Иммунный ответ к антигенам Е1 и С наблюдается быстро, в течение первых недель после инфекции и вакцинации, а иммунный ответ к антигену Е2 отсрочен. Как правило, антитела к Е2 антигену обнаруживаются спустя 3 месяца после инфекции. То есть, если обнаружены антитела к Е2, от начала инфекции прошло как минимум 3 месяца.

Оценка интенсивности линий
Интенсивность линий на стрипах пациентов сравнивается с контрольным стрипом.

Линии	Интенсивность	Результат
Нет реактивности	-	Отрицательный
Очень слабая интенсивность (слабее чем слабоположительный Е2 контроль)	+/-	Пограничный
Слабая интенсивность (такой же интенсивности, как слабоположительный Е2 котроль)	+	Положительный
Сильная интенсивность (сильнее, чем слабоположительный Е2 контроль)	++	Положительный

Интерпретация:

Е1-Е2 С Е1	Е2	Стадия инфекции
Линии не определены +	Отрицательный	Нет IgG антител против вируса краснухи Свежая инфекция не может быть исключена
Одна или более линий определены +	Отрицательный	Присутствуют IgG антитела против вируса краснухи Не вырабатываются антитела против Е2 Возможна свежая инфекция
Одна или более линий определены +	Положительный	Контакт с антигеном вируса краснухи был более, чем 3 месяца назад

Рис. 3. Маркеры краснухи по Б. Пустовойту.

Отрицательный результат теста не может исключать инфекцию краснухи. Возможно, что антитела к краснухи еще не выработались или присутствуют в неопределяемом количестве, особенно на ранней фазе инфекции.

Если имеют место сомнительные результаты теста, рекомендуется обследовать пациента в динамике.

Если есть подозрения на свежую инфекцию, определяются IgM-антитела. Однако, в отношении методов определения IgM-антител краснухи существует ряд диагностических проблем:

IgM-антитела краснухи обычно определяются у пациентов 1-2 месяца. Однако у некоторых пациентов они могут персистировать более длительное время.
IgM-антитела краснухи также определяются в случаях реинфекции краснухи во время беременности, когда риск повреждения плода очень низкий.
Тесты на IgM-антитела краснухи иногда могут давать ложные положительные результаты, например, при интерференции ревматоидного фактора.
Инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барра, может приводить к выработке специфичных для вируса краснухи IgM-антител через неспецифичную поликлональную стимуляцию В-лимфоцитов.

6. Диагностика антител класса IgМ к инфекциям TORCH-комплекса методом иммуноблоттинга

Иммуноблот для качественного дифференцированного определения IgM-антител в сыворотке или плазме крови человека к токсоплазме, вирусу краснухи, цитомегаловирусу, ВПГ-1 и ВПГ-2.

Антигены: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны, на которые нанесены клинически значимые антигены в определенном порядке (Лайн-блот). Источником антигенов для теста TORCH Profile EUROLINE IgM (EUROIMMUN, Германия) являются:

Токсоплазма: лизат культуры Toxoplasma gondii, обработанный ультразвуком и γ-лучами.
Краснуха: антигены получены путем инактивации лизата клеточной культуры Vero, инфицированной вирусом краснухи штамма "HPV-77".
Цитомегаловирус: инактивированный клеточный лизат культуры MRC-5, инфицированной цитомегаловирусом штамма "AD169".
ВПГ-1: выделенный гликопротеин С1.
ВПГ-2: выделенный гликопротеин G2.

Интерпретация результатов:
Реактивность к одной из инфекций определяется как соответствующая темная линия на стрипе.

7. Диагностика антител класса IgМ/IgG к вирусу Эпштейна-Барра методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции

Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgМ-антитела и/или IgG-антитела к антигенам вируса Эпштейна-Барра.

Антигены: Источником антигенов для тестов Anti-EBV WESTERNBLOT (EUROIMMUN, Германия) является полный экстракт антигенов вируса Эпштейна-Барра (штамм P3HR1). Белки вирусного экстракта были разделены по молекулярной массе методом прерывистого электрофореза в полиакриламидном геле и эти белки были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану блотовых стрипов. Нанесенные на стрипе вестерн-блота антигены:

Нанесенные на стрипе вестерн-блота антигены:

капсидный антиген

ранний антиген

ядерный антиген

другие антигены

р125, р65, р42, р41, р40, з33, р22 (р22 – является маркером поздней фазы EBV-инфекции)

ЕА-R p93,

EA-D p45,

EA-D p43

EBNA-1 p79

p27

Рис. 4. Стрип для диагностики ВЭБ-инфекции с нанесенными на него антигенами.

Результаты постановки реакции с набором Anti-EBV WESTERNBLOT можно разделить на отрицательные, неопределенные и положительные:

Результат	Характеристика
CA
Отрицательный	Отсутствуют положительные полосы CA.
Неопределенный	По крайней мере одна положительная полоса CA средней интенсивности.
Положительный	По крайней мере одна положительная полоса CA сильной интенсивности.
EA
Отрицательный	Отсутствуют положительные полосы EA.
Неопределенный	По крайней мере одна положительная полоса EA средней интенсивности.
Положительный	По крайней мере одна положительная полоса EA сильной интенсивности.
NA
Отрицательный	Отрицательная полоса NA.
Неопределенный	Положительная полоса NA средней интенсивности.
Положительный	Положительная полоса NA сильной интенсивности.

Интерпретация результатов по статусу инфекции:

Статус инфекции	Результат теста Anti-EBV WESTERNBLOT
Отсутствие	Отсутствуют полосы специфических антигенов или они дают только очень слабые сигналы.
Первичная инфекция	Присутствует, по крайней мере, одна положительная полоса CA сильной интенсивности в тестах на IgG-антитела и IgM-антитела. Замечание: Приблизительно в 5% случаев антитела класса IgM к антигену CA не образуются. Исследования с образцами клинически охарактеризованных сывороток показали, что в этих случаях при первичной инфекции могут выявляться антитела класса IgG к CA в сочетании с антителами класса IgM к NA и р27.
Поздняя фаза инфекции	Присутствует полоса NA и, по крайней мере, одна положительная полоса VCA сильной интенсивности в тесте на IgG-антитела. Замечание: Приблизительно в 5% случаев антитела класса IgG к антигену NA не образуются или титр этих антител падает. Исследования с образцами клинически охарактеризованных сывороток показали, что в этих случаях на поздней стадии инфекции могут выявляться антитела класса IgG к полосе р22 CA.
Реактивация	Присутствует положительная полоса NA в тесте на IgG-антитела и, по крайней мере, одна сильная полоса CA в тесте на IgG-антитела или, по крайней мере, одна сильная полоса ЕA в тесте на IgG-антитела или, по крайней мере, одна сильная полоса CA в тесте на IgМ-антитела. Полоса NA в тесте на IgG-антитела отрицательная и присутствует, по крайней мере, одна сильная полоса CA в тесте на IgG-антитела при отрицательных полосах CA в тесте на IgМ-антитела и, по крайней мере, одной сильной полосе ЕA в тесте на IgG-антитела. Следующее сочетание полос может отражать как реактивацию, так и первичную инфекцию с отсутствием антител к BA: полоса NA отрицательная и, по крайней мере одна сильная полоса CA положительная в тесте на IgG-антитела; отрицательны полосы антигенов ЕА и CA в тесте на IgМ-антитела.

Схема диагностики ВЭБ-инфекции:

8. Диагностика антител класса IgG к вирусу гепатита С методом иммуноблоттинга

Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgG-антитела против вируса гепатита С. Используется для подтверждения положительных результатов, полученных при скрининговых исследованиях.

Антигены: для теста RecomBlot HCV IgG 2.0 (MIKROGEN, Германия) используются очищенные рекомбинантно созданные антигены:

NS-3	Неструктурный протеин с хеликазой / протеазная активность	70 кДа
Геликаза (Helicase)	Неструктурный протеин с хеликазой / часть NS-3 с хеликазной активностью	40 кДа
NS-5-12	Неструктурный протеин / часть NS-5	30 кДа
NS-4	Неструктурный протеин / N- терминальная часть NS-4	27 кДа
Core	Вирусный капсид / структурный протеин	14 кДа

Оценка интенсивности линий

Интенсивность линий на стрипах пациентов сравнивается с контрольным стрипом.

Линии	Интенсивность
Отрицательная	-
Слабо-положительная (видимая, но слабее чем core-антиген слабо-положительного контроля)	+/-
Интенсивность хорошо различимая (такая же интенсивность как у core-антигена слабо-положительного контроля)	+
Сильная интенсивность (более сильная, чем у core-антигена слабо-положительного контроля)	++

Интерпретация исследования

Результат исследования получается прибавлением значений отдельных линий, которые определяются как +/-, + или ++(см. таблицы).

Значения линий HCV-антигенов RecomBlot HCV IgG:

+/-

+ или ++

NS-3

Helicase

NS-5-12

NS-4

Core

Интерпретация результатов исследования:

Сумма линий

Оценка

0-5

6-9

Негативный

Пограничный

Положительный

Пациенты с пограничными результатами должны быть повторно обследованиы после 3-4 недель. Если при этом результаты с изолированными реакциями против NS-антигенов не показывают каких-либо изменений, то это может быть вызвано перекрестной реактивностью. Так же это может указывать на остаточный титр после инфекции или на неспецифическую реакцию с рекомбинантными антигенами.

Для подтверждения положительных результатов исследования рекомендуется ПЦР для определения генома HCV.

Отрицательные результаты исследования не исключают вирусную инфекцию. HCV-антитела могу не обнаруживаться у гемодиализных пациентов, несмотря на положительные результаты ПЦР-методом.

9. Правила забора биоматериала для исследования на иммуноблоте

Материалом для исследования является венозная кровь, которая берется из локтевой вены.
Используется обычная сухая пробирка или вакуумная пробирка с красной крышкой. Возможен забор крови в вакуумную пробирку с фиолетовой или с синей крышкой.
Количество забираемой крови: для исследования на одном стрипе необходимо забрать 1,5-2 мл крови.
Кровь пациента до передачи курьеру должна храниться в холодильнике (+2 - +4?С) или в контейнере с хладогеном.
Пробирки с кровью отдаются курьеру вместе с направлениями. Номера пробирок должны соответствовать номерам на направлениях.
Кровь отправляется в лабораторию в день забора. До следующего дня цельную кровь хранить нельзя!
Если невозможно кровь пациента передать в лабораторию в день забора, то необходимо отделить сыворотку от форменных элементов крови. Для этого необходимо: центрифугировать кровь после образования сгустка при 1000 об/мин в течение 10 минут, затем отобрать сыворотку в одноразовую пластиковую пробирку типа eppendorf (1,5 мл). Отобранную сыворотку хранить в холодильнике можно в течение 1-2 дней.

Форма направления на исследования методом иммуноблота:

При подготовке информации были использованы оригиналы инструкций к наборам "EUROIMMUN", "MIKROGEN" и опыт работы лаборатории

Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний Новые возможности Практическое руководство по интерпретации полученных результатов М.В. Маркина, В. В. Романов